目 录
一、摘要
中文摘要 – 3 –
英文摘要 – 5 –
二、英文缩略词表 – 8 –
三、正文
前 言 – 9 –
材料与方法 – 11 –
实验结果 – 16 –
讨 论 – 20 –
小 结 – 23 –
结 论 – 23 –
四、参考文献 – 24 –
五、附录
综 述 – 26 –
个人简介 – 60 –
在学期间科研成绩 – 60 –
致 谢 – 62 –
摘 要
乳腺癌仍然是威胁全球妇女健康的最常见癌症之一。预计其发病率和死亡率将在未来几年内继续增加。其中，三阴性乳腺癌所占比例约不到四分之一。相对于其他亚型的乳腺癌三阴性乳腺癌更具侵略性，并可能通过局部浸润扩散或血液及淋巴循环引起远处转移，以及具有高复发率的特点。自噬与多种生理功能有关并且被认为是维持细胞体内平衡的关键过程。同时，对癌症细胞而言自噬也是一种有效的逃逸机制，它和各种癌症对药物的耐药性相关。自噬通常是由几种自噬相关蛋白的协同作用引发的，一开始自噬体会把部分的细胞质和细胞器包围在自己体内，然后会与溶酶体结合转变成自噬溶酶体，最终自噬溶酶体会降解。多种研究表明，中药治疗有在一定程度上减少传统治疗时的不良反应及降低耐药性等优势。并且近年来，在中药提取物对肿瘤作用的研究上也获得了越来越多的关注。柴胡皂苷D（SSD），一种以柴胡为原材料提取的三萜皂苷。现有的研究报道显示，柴胡皂苷D的功能十分复杂，已经发现的功能有抑制多种肿瘤细胞的增殖，其中不仅有卵巢癌和肺癌，还包括肝癌和成胶质细胞瘤等。
目 的： 本研究旨在探讨Saikosaponin D（SSD）对人乳腺癌MDA-MB-231在细胞凋亡和自噬方面的作用。
所需材料和实验步骤： 首先要进行对细胞的培养，将其培养在96孔板当中，每个孔板用相异浓度的药物，培养时间为半天，一天还有2天时间。然后，将每个孔中的细胞用CCK-8溶液处理后，在37℃温育2小时，使用酶标仪测量450nm处的吸光度值；取对数生长期的MDA-MB-231细胞，先对细胞悬液密度进行调整为3×105 个/ml，之后接种到6孔板中，每孔2ml，等待细胞生长达到70%左右的时候，对其进行加药处理，药物处理时间为一天，用FITC-AnnexinV和碘化丙啶进行染色，随后通过FlowJo软件进行分析；电镜下观察自噬小体；采用浓不相同的SDS-PAGE胶分离蛋白质。把分离的蛋白质转移至PVDF膜上，并选用5％牛奶在室温下对其封闭半小时。把膜与一抗置于4℃的温度下孵育过夜；将培养的细胞用pCMV-mCherry-GFP-LC3B转染，加入药物处理24小时，拍照前用4％低聚甲醛固定，最后使用荧光显微镜捕获图像。
结 果：
1.SSD作用于细胞后，12小时的IC50值为5.49μM；24小时的IC50值为6.85μM；48小时的IC50值为10.41μM。
2.通过流式细胞术检测发现，与对照组相比高浓度组（8μM）的早期凋亡和晚期凋亡总百分数有明显的提高(P < 0.05)，低浓度组（4μM）和中浓度组（6μM）和对照组之间没有太大的不同(P > 0.05)。
3.SSD在12h内诱导MDA-MB-231细胞产生大量的胞内空泡。
4.通过共聚焦激光显微镜观察，经Rapa处理的细胞（阳性对照）中黄色和红色点的数量增加。而在SSD处理的情况下，细胞中大量红色和绿色点的形成，并呈现黄色覆盖。
5.LC3BⅡ的表达随着药物浓度和时间增加而增加，在12h达到高峰后下降（RAPA为阳性对照）。P62的表达随着药物浓度的增加而增加，ATG7和Beclin1并没有发生变化。此外采用SSD和CQ对细胞进行处理时，LC3B表达量在数据上比单独用SSD和CQ处理的组更高。
结 论：
研究数据表明了，三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231能被SSD诱导，进而发生凋亡，同时也能够抑制自噬体与溶酶体的融合，从而抑制自噬体的形成。这一结果也为自噬降解的抑制与细胞死亡之间的关联提供了进一步的证据。
关键词：柴胡皂苷D ；三阴性乳腺癌；凋亡；自噬
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