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乳腺癌仍然是威胁全球妇女健康的最常见癌症之一。预计其发病率和死亡率将在未来几年内继续增加。其中，三阴性乳腺癌所占比例约不到四分之一。相对于其他亚型的乳腺癌三阴性乳腺癌更具侵略性，并可能通过局部浸润扩散或血液及淋巴循环引起远处转移，以及具有高复发率的特点。自噬与多种生理功能有关并且被认为是维持细胞体内平衡的关键过程。同时，自噬也是一种有效的癌症逃逸机制，与多种癌症的耐药性有关。自噬通常是由几种自噬相关蛋白的协同作用引发的，首先部分细胞质和细胞器被包裹在双膜结构的自噬体内，之后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最后自噬溶酶体降解。多种研究表明，中药治疗有在一定程度上减少传统治疗时的不良反应及降低耐药性等优势。并且近年来，在中药提取物对肿瘤作用的研究上也获得了越来越多的关注。柴胡皂苷D（SSD）是从柴胡中提取的一种三萜皂苷。已有报道指出，柴胡皂苷D的功能十分复杂，已发现可抑制多种肿瘤细胞增殖，包括卵巢癌，肺癌，肝癌和成胶质细胞瘤等。
目 的： 本研究旨在探讨Saikosaponin D（SSD）对人乳腺癌MDA-MB-231在细胞凋亡和自噬方面的作用。
材料与方法： 将细胞培养在96孔板中，并用不同浓度的药物分别培养12小时、24小时和48小时。然后，将每个孔中的细胞用CCK-8溶液处理后，在37℃温育2小时，使用酶标仪在450nm处对吸光度值进行测量；取对数生长的MDA-MB-231细胞，调整密度为3×105 个/ml的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板中，每孔2ml，待细胞生长达到70%左右时可加药处理药物处理24小时后，用FITC-AnnexinV和碘化丙啶染色，随后通过FlowJo软件进行分析；电镜下观察自噬小体；通过不同浓度的SDS-PAGE胶分离蛋白质。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，并在室温下用5％牛奶封闭30分钟。将膜与一抗在4℃下孵育过夜；将培养的细胞用pCMV-mCherry-GFP-LC3B转染，加入药物处理24小时，拍照前用4％低聚甲醛固定，最后使用荧光显微镜捕获图像。
结 果：
- SSD作用于细胞后，12小时的IC50值为49μM；24小时的IC50值为6.85μM；48小时的IC50值为10.41μM。
- 通过流式细胞术检测发现，高浓度组（8μM）相比于对照组早期凋亡和晚期凋亡总百分数显著上升(P < 0.05)，低浓度组（4μM）和中浓度组（6μM）处理组相比于对照组无显著差异(P > 0.05)。
- SSD在12h内诱导MDA-MB-231细胞产生大量的胞内空泡。
- 通过共聚焦激光显微镜观察，经Rapa处理的细胞（阳性对照）中黄色和红色点的数量增加。而在SSD处理的情况下，细胞中大量红色和绿色点的形成，并呈现黄色覆盖。
- LC3BⅡ的表达随着药物浓度和时间增加而增加，在12h达到高峰后下降（RAPA为阳性对照）。P62的表达随着药物浓度的增加而增加，ATG7和Beclin1并没有发生变化。同时用SSD和CQ处理细胞时，LC3B表达量高于单独用SSD和CQ处理组。
结 论：
研究数据表明了，SSD可以诱导三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231发生凋亡，并通过抑制抑制自噬体与溶酶体的融合来抑制自噬体的形成。这为自噬降解的抑制与细胞死亡之间的关联提供了进一步的证据。
关键词：柴胡皂苷D ；三阴性乳腺癌；凋亡；自噬
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