临床医学论文范文大肠杆菌来源的HPV6L1重组蛋白的基础及应用研究

大肠杆菌来源的HPV6 L1重组蛋白的基础及应用研究

摘要

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus HPV）能够引起肛生殖器部位的多种良性及恶性病变。在HPV感染所致疾病中，尖锐湿疣是一种相当常见的性传播疾病。虽然该疾病为良性病变，但是具有反复发作，不易痊愈的特点，往往会给患者带来沉重的心理压力及经济负担。尖锐湿疣主要由HPV6及HPV11感染所引起，其中由HPV6感染所引起的占到了70%。因此，一种有效的HPV6疫苗能够显著减少尖锐湿疣的发生和传播。

研究表明HPV L1蛋白在体外组装而成的类病毒颗粒(Virus-Like Particle VLP)是一种良好的HPV疫苗形式，可以诱导高滴度的抗HPV中和抗体。目前，已有两种HPV VLP疫苗上市，其安全性及有效性也得到了充份的证实。但是上述两种疫苗均采用真核表达系统，生产成本高，产品价格昂贵，难以在发展中国家推广。而大肠杆菌表达系统具有培养条件简单，生产成本低廉的突出优点。若将其应用于HPV6 VLP疫苗的研究中将能够降低疫苗成本，促进该疫苗在发展中国家的推广。本研究尝试利用大肠杆菌表达系统制备具有良好免疫原性及稳定的HPV疫苗，并对该疫苗的结构及表位进行分析。

在本研究中并未以包涵体的形式在大肠杆菌中表达重组蛋白HPV6N5C-L1，而是将目的蛋白以非融合的形式可溶地表达于大肠杆菌中。所表达的HPV6N5C-L1蛋白在经过盐析沉淀，复溶，阳离子交换色谱，疏水相互作用色谱这一系列纯化步骤之后，其纯度能够达到96%以上。经纯化的HPV6N5C-L1很好的保持了其天然构象，可以在缓冲液(10mmol/L PB pH6.0，150mmol/L NaCl)中组装为半径约为25nm左右的空心颗粒，具有典型的HPV6 VLP的形态结构。

在上述HPV6 VLP小量制备方法基础上，本研究进一步进行了HPV6 VLP疫苗的中试研究，以便建立高效，稳定的HPV6 VLP中试工艺。研究结果显示，该工艺不但具有25%左右的较高得率，而且对于目的蛋白具有良好的纯化效果。经过纯化，目的蛋白的纯度能够达到96%以上，而内毒素，外源DNA含量均能够符合药典要求。此外，通过对三批次中试的观察，证实了该工艺同时具有良好的稳定性。

中试研究所制备的HPV6 VLP疫苗需要进一步进行免疫原性及稳定性考察。实验结果显示，本研究制备的HPV6 VLP疫苗的ED₅₀为0.009μg，低于对照组中Merck HPV疫苗Gardasil的0.016μg。在稳定性研究中，HPV6 VLP疫苗原液在25℃放置7Day后，其平均水化半径，HPLC保留时间，沉降系数，体外相对抗原含量均未发生明显变化。在37℃放置7天后，HPV6 VLP的平均水化半径有略微增大，而其余检测指标也未见明显变化。上述研究结果证实了本研究所制备的HPV6 VLP具有良好的免疫原性及稳定性。

由于HPV VLP具有复杂的空间构象，而且HPV疫苗的效果也严格依赖于其正确的空间构象的形成。因此本研究在成功制备HPV6 VLP疫苗的基础上进一步对该疫苗的结构及抗原表位进行研究，以阐明HPV6 VLP的结构及表位特征，为建立全面的疫苗质控体系及进行疫苗设计奠定基础。

结构分析显示，组成大肠杆菌来源HPV6 VLP的五聚体在大小，分子量上均与理论值吻合，并且在一定条件下能够形成晶体，具有正确的构象。而HPV6 VLP为空心圆形颗粒，平均约半径为25nm，表面可见壳粒，具有典型的HPV VLP的特征，与真核来源的HPV VLP无异。通过对多个中试批次样品进行分析，可以发现所制备的HPV6 VLP在颗粒半径，保留时间，沉降系数等指标上具有高度的一致性。

在表位研究中，本研究筛选得到了HPV6 优势中和单抗7A8,13H5，这两株单抗同时还具有HPV6/11交叉中和活性。利用这两株单抗模型与HPV6 五聚体模型的分子对接，可以将HPV6 的优势中和表位定位于HPV6 VLP表面的DE,FG,HI三个环状区域上。而后进一步通过同源扫描的方法验证了上述对接结果，并且进一步将上述表位定位于HPV6 VLP表面的三个区域：V¹³⁸N¹³⁹V¹⁴⁰G¹⁴¹ ，E²⁵⁹V²⁶⁰G²⁶¹E²⁶²P²⁶³V²⁶⁴P²⁶⁵D²⁶⁶ T²⁶⁷L²⁶⁸ I²⁶⁹I²⁷⁰, S³⁴⁵T³⁴⁶ Y³⁴⁷T³⁴⁸ N³⁴⁹ S³⁵⁰ D³⁵¹Y³⁵²。

综合上述结果，本研究成功利用大肠杆菌表达系统制备了HPV6 VLP疫苗，验证了其稳定性，有效性及结构正确性，并且对其优势中和表位进行了定位。这些工作将为HPV6 疫苗研究及新型HPV疫苗设计提供参考。

关键词：人乳头瘤病毒6型 晚期蛋白L1 大肠杆菌表达系统 类病毒颗粒 疫苗  表位定位

 

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