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雌激素和孕酮对牛子宫TLRs表达及功能的影响
子宫内膜炎是奶牛养殖中常见多发病，严重制约奶牛的繁育能力。病原侵入子宫引起炎症反应，与子宫内膜上皮的功能直接相关，子宫内膜上皮细胞通过TLRs等模式相关识别受体来识别病原微生物，并启动一系列信号传导，引起机体防御性的免疫反应。在临床生产实践中子宫内膜炎的发生与E2和P等性激素的生理周期性变化密切相关，性激素通过调节TLR信号传导通路对机体免疫功能产生影响，但相关细节尚不清楚。
本研究旨在通过体外实验，从TLRs的角度，通过不同的刺激变化，验证TLR2、4的表达及其诱导产生的细胞因子及炎症趋化因子分泌水平的变化情况，从分子水平分析激素对子宫免疫机制的调节作用，寻找E2、P对子宫内膜免疫调节的作用靶点，并为激素治及预防疗子宫内膜炎的后续试验提供理论依据和体外实验数据。
首先，对牛子宫上皮细胞进行培养，分别通过添加LAT、LPS、E2、P，建立细胞模型，确定各种添加物的最佳工作浓度，为后续试验奠定稳定良好的基础。
在E2对子宫内膜上皮细胞TLRs影响的实验中，通过添加E2+LAT/LPS、LAT/LPS+ E2，检测TLR2/4表达及功能的变化，观察炎性物质刺激细胞前后E2所起的作用。结果显示，加入LTA/LPS，TLR2/4的mRNA、蛋白表达水平显著提高，TLR2/4诱导产生的细胞因子和炎症趋化因子的分泌水平显著增加，说明LTA和LPS作为一种PAMP，能够诱导TLR2和TLR4的促炎作用，增加TLRs的生物学活性，并产生细胞因子等产物，在炎症反应中起重要作用。但是E2对LTA/LPS作用下的子宫内膜上皮细胞中TLR2/4的mRNA、蛋白的表达水平有抑制作用，同时，降低了TLR2/4诱导产生的细胞因子和炎症趋化因子的分泌水平，提示E2的调节作用可以通过TLR来进行，主要是通过抑制其诱导产生的细胞因子和炎症趋化因子来实现的。
在P对子宫内膜上皮细胞TLRs影响的实验中，通过添加P+LAT/LPS、LAT/LPS+ P，观察炎性物质刺激细胞前后P所起的作用。结果显示，P对LTA/LPS作用下的子宫内膜上皮细胞中TLR2/4的mRNA、蛋白的表达水平有促进的作用，同时， 刺激后TLR2/4诱导产生的细胞因子和炎症趋化因子的分泌水平也相应有所增加，提示P的调节作用可以通过调节TLRs的表达及生物学活性的变化来进行的，
根据GenBank中已经发表的牛TLR2、TLR4的cDNA序列，设计特异性引物及TaqMan探针，成功地扩增出基因表达水平可以用于定量实验的片段，建立了灵敏、准确性、稳定性均较好的检测荧光定量RT-PCR方法，分别对添加E2+LAT/LPS、LAT/LPS+ E2、P+LAT/LPS、LAT/LPS+ P后TLR2/4mRNA的表达水平进行定量检测。结果发现，通过上述刺激以后，TLR2/4mRNA的表达水平由高到低依次为E2、P、LTA/LPS、LTA/LPS+ E2、E2+LTA/LPS、P+LTA/LPS、P+LTA/LPS。本实验应用定量的方法进一步证实E2、P对TLR2、4表达的调节作用，同时建立了快速稳定的TLR2、4的定量检测方法，特异性高，灵敏性强。
上述结果证实牛子宫内膜上皮细胞有TLR2、4 mRNA及蛋白的表达，表达情况随配体LTA/LPS的刺激、P的作用而增加（P < 0.05），但随着E2的作用而减低（P < 0.05）。同时检测了LTA/LPS诱导TLR2/4产生的细胞因子、趋化因子IL-1、IL-8、TNF-α的分泌情况，证实三种具有代表性的细胞因子的分泌水平随着LAT/LPS、P的刺激而增加（P < 0.05），但随着E2的刺激降低（P < 0.05）。
研究证明，TLR2、4表达和功能的调节可以通过E2、P进行，诱导产生的细胞因子和趋化因子是正常子宫内膜功能及炎症的发病机制中的关键，如子宫内膜炎的子宫内膜功能障碍。TLR2、4识别细菌的LTA和LPS以及由此产生的生产的细胞因子和趋化因子是子宫内膜受病原菌入侵后保护作用的关键。同时证明E2、P对子宫内膜上皮细胞免疫水平的影响是通过调节TLRs的表达及生物学活性来实现的。因此E2/P对TLR2/4功能的影响，特别是抑制/促进细胞因子和炎症趋化因子的分泌和释放，是维护和捍卫子宫内膜的关键。
关键词：
牛子宫内膜炎，Toll样受体，雌激素，孕酮，细胞因子
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