可变剪切对非小细胞肺癌患者的临床预后分析及验证
摘要
研究目的：在全球范围内，肺癌成为各类肿瘤中病发率以及死亡率首位的恶性肿瘤，其中85％的患者可以划分为非小细胞肺癌（NSCLC）这一亚型。在过去的十几年来，种类繁多的靶向药相继上市，但是为何在针对同一靶点用药时，病人的获益情况却大有不同？这个问题一直是肿瘤研究的焦点。近来，研究者发现在肿瘤中普遍存在可变剪切的现象，可变剪切（Alternative splicing）是基因转录所产生的前体mRNA通过去除内含子区域，选择性地保留或排除特定外显子，从而生成编码不同蛋白质的各种转录本。通过这种方式，同一基因能够编码并翻译成多种不同或是具有微小差异的蛋白，从而表达不同的功能。这一观点为解释肿瘤的异质性开辟了新的思路。目前，可变剪切在非小细胞肺癌中的研究较少，因此，为了探索其对非小细胞肺癌患者预后的影响以及作用机制，我们开展了本次研究。
研究方法：首先，收集The Cancer Genome Atlas数据库中522例腺癌（LUAD）以及573例鳞癌（LUSC）病例的测序数据，基因表达数据和临床数据。其次，收集青岛大学附属医院胸外科术后病理诊断明确的40例腺癌和20例鳞癌患者的新鲜组织。
- 通过设置严格的标准筛选TCGA的病例，并按照性别将LUAD与LUSC内部再次分成两个亚组，通过TCGA SpliceSeq软件处理测序数据从而得到病人每种可变剪切事件（AS）的PSI数据，随后与临床数据以及表达数据相匹配。
- 选取每组中的配对样本计算肿瘤组织和正常组织中显著差异表达的AS事件，随后通过统计学方法计算哪些事件为独立预后因素并建立多因素风险比例回归模型。
- 上游调控因子探索：选取每组中的配对样本计算肿瘤组织和正常组织中显著差异表达的可变剪切因子（Splicing factor），随后将差异SF与预后AS做相关性分析；下游功能机制探索：用预后相关的剪切事件所对应的亲本基因进行功能富集分析
- 临床应用：对每组的临床数据进行单因素Cox回归分析，将value < 0.05的临床指标与多因素风险比例回归模型一同建立可视化Nomogram模型。
- 实验验证：提取收集的新鲜组织样本的总RNA，并反转为cDNA。设计特异性的两段引物，通过qPCR来获取每个组织的PSI数据，随后进行配对样本的差异分析，验证剪切事件的发生。
结果：通过分析，LUAD中男性与女性亚组中各确定8种剪切事件为独立预后因素；LUSC中男性与女性亚组中各确定7种剪切事件为独立预后因素，所建立的多因素风险比例回归模型的ROC值也均在0.75以上。我们建立了一个SF与AS调控的相关性网络，也根据风险因素预测了其下游可能存在的调控机制。此外，所建立的Nomograms模型的C指数均在0.7以上，矫正曲线也显示模型稳定。最终，挑选的四种剪切事件也的确在肿瘤和正常组织中存在显著的表达差异。
结论及意义：我们以可变剪切为出发点，通过系统的分析发现在非小细胞肺癌中不同性别的患者其剪切特征却有不同。据此我们探索了包括上游调控因子以及下游信号通路在内的完整作用机制，并在组织样本中进行了初步验证。此外，为了拓展可变剪切在临床上的应用，我们将可变剪切的风险比例回归模型与临床指标结合起来，可以用于预测病人早期复发和肿瘤预后。综上所述，我们的研究对探索转录本的多样性对非小细胞肺癌的产生和发展的影响具有重要意义，我们所发现的各个独立预后因素均可作为后续研究的方向，临床模型也将指导临床医生判断患者肿瘤的预后和复发情况。
硕士研究生：
指导教师：
关键词：可变剪切；非小细胞肺癌；预后；
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